[00064127]Ⅰ型糖尿病病人的诊断与治疗的新制剂

技术投资分析： 　　谷氨酸脱羧酶是特异性催化L-谷氨酸脱羧生成γ－氨基丁酸(GABA) 的一种酶。它有两种同功酶形式－GAD67（67kDa）和GAD65(65kDa)，在人类胰岛中仅有GAD65表达。人GAD65由585个氨基酸组成，分子量约为65KD。 　　研究发现：Ⅰ型糖尿病是一种遗传易感个体通过自身抗原介导的免疫反应所引起胰岛β细胞破坏的自身免疫性疾病，GAD65是此免疫反应关健的始动靶抗原。在T1DM病人以及85%左右T1DM新近患者的血清中含有针对GAD65的抗体。此外，80%左右"高风险"倾向于患T1DM的人群的血清中也存在针对GAD65的抗体。表明：针对GAD65的抗体GAD65-Ab早在Ⅰ型糖尿病临床发作前几年或十几年就已经出现。迄今为止，GAD65-Ab是诊断Ⅰ型糖尿病免疫指标中最有效和特异的一个。 　　同时，用特异性自身抗原进行免疫治疗已经作为防止T1DM的手段被尝试。有报道说对幼龄NOD小鼠通过静脉或胸腺注射GAD65蛋白进行免疫，可以使胰岛β细胞对针对其的T细胞介导的免疫应答产生免疫耐受，进而防止糖尿病的发生。此外，对GAD65的免疫耐受也能阻止NOD小鼠中经常发生的其它免疫反应，例如针对HSP65免疫反应，表明NOD小鼠中GAD对针对β细胞的自身免疫反应的起始是关键的。通过腹腔注射GAD免疫幼龄NOD小鼠，发现与对照组相比显著阻止了糖尿病的发病。另外，发病后用GAD65对NOD小鼠的免疫能延缓糖尿病的进展。最近一项对LADA（成人隐匿性自身免疫糖尿病）患者进行的GAD65免疫耐受Ⅱ期临床实验表明：在肌肉注射一定剂量重组人GAD65进行免疫后，患者外周血液中C-肽水平以及能抑制自身免疫的CD4+/CD25+ T细胞都有明显增加，未发现任何明显的不良反应，初步证明了采用GAD65进行免疫耐受来防止T1DM发生的安全性。 　　综上所述，用GAD来检测GAD-Ab的存在可作为T1DM的预测和诊断手段；可应用于从T2DM患者中鉴别出隐匿性T1DM患者，使患者能够进行早期干预治疗；也可作为一种普查手段，用来发现T1DM的高危人群。同时，采用GAD65进行机体的免疫耐受来预防和治疗T1DM将有很大发展前途。 　　目前，采用从天然组织中分离纯化以及人工化学合成的方法获得大量人GAD65蛋白质是不现实的。国外已经有研究者尝试在兔网织红细胞、酵母细胞、昆虫细胞以及大肠杆菌等表达体系中尝试表达天然重组人GAD65，但发现存在以下几个缺点：1、人GAD65表达量很低，并且GAD65-Ab检测方法设备要求高，仅能用于实验室分析；2、人GAD65的表达主要以包涵体形式表达，且很难进行正确的复性，导致蛋白质没有酶学活性和免疫活性；3、耗时费力，花费巨大，不适合中国国情。基于以上几个方面，迫切需要研制国产化的高效低价的能够广泛应用的制备人GAD65方法。 　　本项目研究通过基因工程的方法，从人胰岛中获得人GAD65基因，然后把人GAD65与硫氧还蛋白（Trx）及His Tag进行融合表达。通过这种策略，一方面，利用硫氧还蛋白的存在为整个细胞提供一个还原性的环境便于人GAD65蛋白质分子的正确折叠；另一方面，利用多聚His纯化标签的存在大大简化纯化过程；同时肠激酶酶切位点的存在可便于硫氧还蛋白融合标签的去除。我们找到并构建了一种高效表达人GAD65，即能生产可溶的有活性的人GAD65蛋白质的基因工程菌。后续研究证明，这种策略是正确可行的，我们已经获得有生物活性的人GAD65蛋白质，从而为将人GAD65开发成为高效的Ⅰ型糖尿病诊断、预防和治疗药物打下坚实的基础。 项目的创新性和先进性： 　　⑴国内第一次成功实现大肠杆菌原核表达系统表达人谷氨酸脱羧酶65 　　⑵与国外相关研究相比，本研究在大肠杆菌原核表达系统中人谷氨酸脱羧酶65可溶性表达量明显提高。 　　⑶本研究创新的建立了一种非放射性的、简便易行、灵敏度高的人谷氨酸脱羧酶65酶学活性检测方法。 项目的研发阶段： 　　⑴完成了目标基因的克隆表达鉴定工作 　　⑵完成了基因工程菌的发酵工艺 　　⑶完成了基因表达产物的分离纯化工艺研究 　　⑷进行了基因产物部分性质研究 　　⑸将目标基因产物用于Ⅰ型糖尿病的诊断进行了初步研究 知识产权状况： 已申请中国专利。 技术的应用领域前景分析： 项目的产业化和市场前景： 研究表明这些患者具有从T2DM转变为T1DM的倾向。从T2DM人群中诊断出这些LADA患者将有助于患者进行早期的干涉治疗。因此，开发高效价廉的预防、诊断、治疗T1DM的药物具有重要的应用价值。 项目的应用领域： 　　人Ⅰ型糖尿病的诊断、预防和治疗。 效益分析： 　　糖尿病是一种严重的世界性疾病，发病率一直居高不下。目前，全世界糖尿病患者总数近2亿，估计到2010年将上升到2.2亿，2025年将超过3亿。在这庞大的糖尿病人群中，约有10％是1型糖尿病（T1DM）病人。并且，大多数患者是青年人。其余90％的2型糖尿病（T2DM）人群中也有很大一部分是成人隐匿性自身免疫糖尿病患者（LADA）。 厂房条件建议： 无 备注： 无