[00056342]植物组织培养与工厂化育苗技术

一、引言

　　植物组织培养是在19世纪细胞学说的基础上，于20世纪初期初步获得成功的生物技术。此后，在植物细胞全能性学说的推动下，植物组织培养技术得到了迅猛的发展，在理论和应用方面都取得了很大的进展。组织培养技术已不仅是生物科学研究的一种极为有用的手段和方法，而且已逐步走向产业化应用的道路，加速和推动了农业生产和生物制药等各个领域的技术革命。

　　随着我国市场经济的进一步发展和人民生活水平的不断提高，果树、蔬菜和花卉等经济作物在农业生产中所占比重也日趋增长，对各类苗木的数量、质量和纯度的要求也越来越高，一般常规的苗木繁殖技术已难以保证大规模迅速发展的需求。于是应用现代高新技术——植物组织培养快速繁育优良品种的无性系苗木和应用生物技术培育新品系、新品种，创建有自主知识产权的新产品，便有了无限广阔的应用前景，既有深远的社会效益，更有直接的经济效益。

　　二、植物组织培养基本概念

　　利用植物体的器官、组织或细胞乃至原生质体，通过无菌操作后接种在人工配制的培养基上，在适宜的光照和温度条件下进行培养，使之分化、生长、发育的技术统称为植物组织培养。由于培养物是脱离了植物母体，在试管或其他容器中进行培养，所以也叫离体培养。

　　（一）植物组织培养常用术语解释

　　1．外植体 由植物（母体）上取来用作离体培养的材料被称为外植体。

　　2．初始培养 最初接种在培养基上的外植体的培养为初始培养。

　　3．继代培养 将获得的增殖的培养体（芽、茎段或带愈伤组织的丛芽团块等）移植到新鲜的培养基上再次或反复多次的切割移植培养。称为继代培养。

　　4．继代周期 前后二次继代培养的间隔时间（天数）称为继代周期。

　　5．增殖系数 后一次培养物（芽或团块）的数量比前一次培养物增加的倍数称为增殖系数。譬如，一个芽（或小团块）经过一个月培养后长成丛芽，经过切割分离成7个芽（或小团块）转移到新鲜培养基上进行继代培养，那么它的增殖系数即为7，继代周期为一个月（30天）。

　　脱分化 如果初始接种在培养基上的外植体，不是通过芽原基萌发的途径直接生长，而是首先形成愈伤组织，再行分化为不定芽或无性胚时，这种初始培养被称为脱分化，所用的培养基被称为脱分化培养基。

　　7．分化培养 经过脱分化阶段的外植体（形成愈伤组织，或肉眼看不到愈伤组织），转移到另一培养基上分化出芽（或小球茎）或胚时，则称为分化培养，所用的培养基也就称为分化培养基。

　　8．增殖培养 已分化芽、小球茎（芽丛或小球茎团常称为团块）和无性幼胚再继续进行增殖，即为增殖培养，所用的培养基则为增殖培养基。

　　9．生根培养 诱导生根形成完整植株，就是生根培养，所得到的完整小植株便称组培苗。

　　（二）植物组织培养技术分类

　　1．按外植体来源分类

　　（1）胚胎培养 外植体为胚、胚乳、胚株、珠心或子房等，以及在试管中进行试管受精等。

　　（2）花粉培养 外殖体为花药或直接取花粉粒进行培养，其主要目的是诱导形成单倍体植株。

　　（3）器官培养 取植物体的根、茎、芽、叶、花、果等器官或其部分组织进行培养。

　　（4）愈伤组织培养 从植物上任一部分取来的离体材料，通过激素等诱导形成愈伤组织来进行培养。愈伤组织的生长没有明显的极性，只有内外的生长陡度，一般是外围的细胞分裂和生长比内部的快，能长期继代培养而不衰退，可以连续继代扩增愈伤组织，或通过愈伤组织诱导产生不定芽或无性胚等。

　　（5）细胞培养 通过机械或化学的方法，将植物细胞分散成单细胞，进行细胞悬浮培养或单个细胞的培养，建立细胞无性系。

　　（6）原生质体培养 通过酶解等方法将细胞除去细胞壁后，用分离获得的原生质体来进行培养。培养的原生质体可通过细胞融合获得种间杂种或新品种。原生质体也是遗传操作的良好受体材料。

　　2．按应用目的分类

　　（1）无性系的增殖扩繁 利用植物体的器官或某一部分组织的细胞进行无性增殖。如在植物组织培养快速育苗中，主要应用营养器官如芽或顶端分生组织、鳞茎等进行培养，这样培养获得的营养系后代相对变异最小，可以保持原品种的品种特性，进行所谓工厂化育苗繁殖各种优良品种或优良单系。无性系的增殖扩繁尤其是悬浮培养的细胞无性系也可用于提炼生产各种药物、调味品等生物制品。在培养过程中通过对培养基和培养条件的调节，常可提高所需有效成分的含量而提高生物制品的产量。

　　（2）获取无病毒苗 在试管内利用微茎尖（＜0.1～0.2毫米）培养，并结合应用热处理等技术，可以脱除植物的多种病毒，获得无病毒的种苗。

　　（3）杂交育种 在试管内无菌培养条件下进行人工授精，或利用原生质体融合获得杂种细胞并进行培养。常用于育种研究和获得杂种后，培育新品种（系），有利于克服远缘杂交不亲和的难题从而创造新物种。

　　（4）人工诱变筛选育种 在组织培养过程中，结合各种人工诱变技术，如染色体加倍、辐射诱变、化学诱变等，对诱变的细胞或组织进行培养诱导和筛选。常用于人工诱变育种。

　　（5）植物外源基因导入 将外源目的基因的DNA片段通过高压基因枪或农杆菌的质粒DNA栽体导入目标植物的外植体细胞或原生质体，并进行再生诱导和筛选培养。常用于生物工程育种，能有目的地改良植物的某种性状。

　　三、组织培养技术的应用

　　近年来，随着组织培养技术的不断发展，该技术已成为生物科学研究的重要手段之一，对植物生理、生化、病理、细胞分化、细胞器功能、染色体遗传、基因标记定位、基因工程、细胞融合等诸多方面的研究都起到了推动作用。在种质资源的保存和交换、育种和快速繁殖无性系及进行药物生产等方面也已获得了广泛的实际应用效果。

　　（一）种质资源的保存与交换

　　试管内保存植物种质资源材料，特别是保存无性系材料可以大大地节省土地、人力、物力和财力。而且，便于种质资源材料的远距离之间的交换，可以有效地避免病虫害的人为传播。保存的方法，一般按保存的时间可以分为二种。一种是在培养基中添加某种生长抑制剂，如多交唑等，在一定的低温条件下可以保存数月或1年才继代培养一次；另一种则是利用液氮冰冻保存，可以保存数年。

　　（二）组织培养育种

　　1．胚培养 离体胚的培养是组织培养中最早获得成功的器官培养物，它对克服远缘杂交和一些特早熟或无籽果育种中的种子败育等问题的解决有着极重要的意义。如上海农科院园艺所的庄恩及等，利用桃的胚培养技术克服了杂种胚败育的问题，成功地培育出了特早熟的“春蕾”等桃的新品种。在无籽葡萄的育种工程中，也正在研究其杂种幼胚的培养，以期获得无籽葡萄新品种。

　　2．胚乳培养 利用胚乳培养是获得三倍体无籽果实的重要途径，目前在苹果、柑橘、梨、枣、猕猴桃、枇杷等许多重要果树上都已能获得胚乳培养的植株。通过胚乳培养获得的三倍体再经过染色体加倍可望获得六倍体等多倍体植株。一般来说，多倍体植株生长旺盛，果实大，这在育种上同样也具有重要意义。因此，胚乳培养的育种研究常成为果树育种家们颇感兴趣的课题。

　　3．花药培养 利用花药培养诱导花粉形成单倍体植株，不仅可以迅速获得纯系材料，更便于对隐性突变的分离。目前已有上百种以上的植物花药培养获得了成功，有些作物已利用花粉单倍体育出了新品种应用于生产。如1974年中科院植物所与中国农科院烟草所合作，通过单倍体育种方法，仅仅用了三年的时间就育成了烟草新品种“单育一号”，在生产上大面积使用，比常规育种大大地缩短了育种年限。

　　4．胚珠培养 利用胚珠培养也有可能获得单倍体植株。利用胚珠培养结合试管内受精的方法，再与胚培养技术结合起来，有可能在育种工作中克服杂交不亲和等障碍而获得远缘杂交的成功。例如龟谷和日向（1970年）曾用芸苔属植物进行实验，用胚珠培养进行试管内受精，得到了小油菜（栽培品种“雪菜”）×白菜（栽培品种“马纳”）杂种植物。

　　5．原生质体培养 利用原生质体培养筛选突变细胞无性系，进而进行细胞融合，有利于克服远缘杂交不亲和的困难，获得远缘杂种新类型。此外，由于原生质体有胞饮现象，它可以摄取生物大分子（如蛋白质、核酸、病毒、噬菌体等）和细胞器（如核、叶绿体、线粒体等），因此，可以进行外源遗传物质的引入，产生遗传上经修饰的细胞。对开辟新的育种途径和遗传工程研究方面有着巨大潜力。

　　6．诱变与筛选 借助细胞、组织培养（包括愈伤组织培养）进行诱变育种，可以提高诱变效果。如重松（1975年）用秋海棠叶片在White培养基上再生出长约0.5毫米的不定芽时用γ射线处理，得到了银白色斑点叶的变异株。利用组织培养技术常常更便于有目的地筛选突变株系。特别是对抗性（抗盐、抗病等）株系的分离和筛选。这也是极有发展前途的育种途径之一。

　　（三）组织培养工厂化育苗

　　1．快速繁殖 应用组织培养技术，在一定的控制条件下加速繁殖无性系，繁殖速度远比常规的嫁接、扦插、压条分株繁殖要快得多。一个芽每年可以数百万倍的速度繁殖其后代。最早应用组织培养法进行快速繁殖的是兰花，用一个兰花外植体，一年可以繁殖400万个原球茎。又如一个草莓芽一年内可繁殖108个芽，一个苹果芽在8个月内可繁殖6万条苹果幼茎等等。这对加速繁殖珍稀树种、品种、优系或芽变株系极为有用。目前已有不少果树、蔬菜、花卉等经济作物逐步采用组织培养技术，利用具有规模生产条件的试管苗生产线进行大规模的工厂化生产。

　　2．生产无毒苗 组织培养育苗对培养和生产无病毒苗更具有特殊意义和应用价值。如马铃薯及多种花卉的退化，以及果树的早衰、减产和失去商品价值等常与病毒危害有关。通过热处理和利用微茎尖（0.1～0.2毫米）分生组织培养常可有效地脱除病毒，获得“无病毒”母株，再通过茎尖组织培养即可以加速无病毒苗的繁殖。因此，通过组织培养技术培育无病毒苗在生产上已广泛地应用，取得了良好的效果，这对尽快实现无病毒栽培起到了极大的推动作用。当然，所谓无病毒苗并非绝对的无病毒，现时的无病毒苗只是指不带有本地区规定检疫范围内的危害性病毒（包括非潜隐性病毒、潜隐性病毒、类病毒等）。

　　3．生产人工种子 目前所谓的组织培养工厂化育苗多半是利用茎尖组织培养，或通过茎段、叶等组织再生不定芽（或无性胚）进行繁殖。但是，随着人工种子研究的不断深入和发展，不久的将来也有可能发展到进行人工种子的工厂化生产。芹菜、胡萝卜、莴苣、花椰菜、石斛等作物都曾制成人工种子，有些（在美国）已步入商品化。目前人工种子生产中存在和亟待研究解决的最大的问题是要求存放的条件严格，且不能存放太长时间。

　　（四）植物性药物及生物制品的生产

　　通过组织和细胞培养进行药物及生物制品生产、涉及的种类日益增多，下表列举了植物组织培养中可能获得的代谢副产物。有些产物在培养物中有效成分的含量已接近或超过天然植株的水平。如利用烟草根尖细胞悬浮培养，可生产2.9%（干重计）的尼古丁；在薯蓣愈伤组织的细胞悬浮培养中可产生1%～1.6%（干重）的薯蓣皂苷素；在烟草细胞培养中，每克（干重）快速生长的烟草细胞可产生360微克的辅酶Q，这是在所有活细胞中发现的最高含量水平。辅酶Q被用作治疗某些心脏病的药物；此外，日本的进志等人在烟草细胞中发现一种新的磷酸二酯酶并制成商品，用作研究m-RN的生化试剂；又如，近年来不少研究红豆杉的组织和细胞培养时，提取出一种抗癌药物——紫杉醇。实验证明，当在培养基中添加一些芳香化合物如苯甲酸、苯丙氨酸和N-苯酰甘氨酸等可有效地提高紫杉醇的产量。除提取药物外，有人从葡萄中提取出一种带有水果香味的萜类化合物，这种化合物的化学合成往往很困难或很不经济，但它可以用葡萄细胞培养的方法获得。随着组织、细胞培养技术的发展和研究工作的不断深入，将会有更多种类的植物性药物和天然调味品、芳香物以及杀虫剂和除草剂等实验组培工厂化生产。

　　表 植物组培产生的代谢产物

　　代 谢副产物名称

　　生物碱 酶抑制剂 挥发油

　　变应原 乙烯 麻醉剂

　　氨基酸 类黄酮 有机酸

　　蒽酮 调味料 缩氨酸（肽）

　　抗白血病剂 呋喃色酮 香料

　　抗菌剂 呋喃香豆素 酚类

　　抗肿瘤剂 植物生长调节剂 色素

　　苯甲酸衍生物 激素 多糖

　　苯基吡喃酮 免疫化学因子 蛋白质

　　苯醌 杀虫药剂 类固醇、固醇

　　生物转化素 类胰岛素成分 皂角苷、皂角

　　碳水化合物 胶乳 糖

　　强心苷 类脂化合物 甜味剂

　　苯基苯乙烯酮 药物复合物 单宁

　　二蒽酮 萘醌 萜烯、类萜

　　食品乳化剂 核酸及其衍生物 植物病毒抑制剂

　　酶（同功酶） 油 维生素

　　摘自周美瑛（1988）“中国农学通报”，1988,(5):P42

　　（五）遗传工程及其他研究应用

　　目前遗传工程的研究内容可以分为细胞水平和分子水平的研究。细胞水平的研究包括细胞杂交、细胞器移植、染色体工程、突变系筛选、病毒和微生物的吸收等等；分子水平的研究包括带有遗传信息分子的吸收，通过不同基因载体（噬菌体或细菌的质粒等）把不同来源的基因引入植物细胞中，获得转基因植物等等。几乎所有的遗传工程的研究最终都离不开应用组织（细胞）培养技术和方法。

　　应用组织培养方法，在人工控制条件下更有利于研究植物组织、器官、生长发育规律，细胞与组织的分化，器官的形态建成，生理代谢活动和生物合成途径等等。组织培养技术已在生物学的各个方面得到了广泛的应用，对生理学、遗传学、病理学和分子生物学等各方面的研究都起到了推动和促进作用。

　　总之，随着科学技术的发展，组织培养技术的应用范围将日趋广泛，并渗透到农业、医药业、食品工业等和人民生活的各个领域中，加速推动这些事业的发展。