[00047726]重组海蛇毒素基因工程药物

　　海蛇中含有多种肽类毒素。肽类毒素及其作用机制是发现新的神经系统或心血管系统特效药的重要导向化合物和线索。它们通过与人生理活性中关键部位，例如：心脏和神经细胞上的膜受体、离子通道等，与细胞内的关键酶相结合而发生作用。我们运用基因工程技术开发、生产肽类毒素，经过功能筛选和临床前药理学研究，最终研制开发出以肽类毒素为基础的一类新药，在治疗肿瘤、心脑血管疾病和神经系统疾病方面具有重要的临床应用价值。 　　我们采集了海蛇新鲜的毒素分泌组织，提取分析了其mRNA，建立了cDNA文库，经过基因转染、表达及克隆筛选，并进行测序及分析，建立了肽类毒基因高效表达的系统。小试生产一批败类毒素，开始进行临床前药理实验及产业化开发研究，其中蛇毒镇痛剂已有较明朗的开发前景(用于风湿性关节痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、晚期癌肿痛和麻风神经痛等，其主要优势在于：止痛作用快，效果好，连续用药不会产生耐药性，无成瘾性，用药剂量少，一般没有严重的毒副作用--国际上临床应用镇痛剂的理想特性)。 　　本项目由国家高科技海洋领域863计划支持，开发的新药具有自主知识产权，有着广阔的国际市场，每个新药的销售总额在十亿元人民币以上。 　　技术路线： 　　1．收集新鲜的海蛇毒腺 　　2．海蛇毒腺mRNA的提取与分析。 　　3．mRNA的逆转录 　　4．cDNA文库的建立。 　　5．对亚文库克隆大规模测序 　　6．新基因的生物信息学研究和功能鉴定 　　7．海蛇毒素高效原核表达系统的建立 　　本实验室构建的pETTrx可溶性融合表达载体表达量高，同时由于在6His位点后加入了G-SLinker区，使6His位点有足够的Ni2+亲合柱结合，大大降低了蛋白纯化的难度，使表达产物经过一步纯化就可以得到较高的纯度，实验证明这是一个高效实用的表达载体系统。 　　8．海蛇毒素的表达及活性分析 　　1．含空载PETtrx的BL21-DE3总菌体； 　　2．含质粒PETTRX12#R的BL21DE3总菌体； 　　3.含质粒PETTRXl2#的BL21-DE3的超声上清； 　　4．Ni2+亲合柱穿流峰； 　　5．Ni2+亲合柱pH6.0洗脱峰； 　　6．Ni2+亲合柱150mM咪唑洗脱峰； 　　7．Ni2+亲合柱500mM咪唑洗脱的目的蛋白； 　　8．进一步纯化的TRXl2#重组蛋白； 　　9．蛋白分子量标准。 　　目前本课题研究己取得以下阶段性成果： 　　1．建立了3个高质量的海蛇毒腺cDNA表达文库(cDNA克隆数目接近106)，这三种海蛇分别为平颏海蛇、青灰海蛇和一种未知名的海蛇(正在请专家鉴定之中)。 　　2．建立了细胞水平的抗肿瘤新药筛选模型，肿瘤细胞包括了肝癌、鼻咽癌，胃癌细胞等，并对平颏海蛇毒素cDNA亚文库进行了功能筛选，结果显示大部分亚文库具有细胞致死作用。 　　3.通过对平颏海蛇cDNA亚文库近500个克隆的鉴定和序列分忻，得到77个海蛇新基因序列(其中38个已在Genbank上登录)，包括神经毒素基因4个，PLA2基因3个和2个半胱氨酸丰富的毒蛋白基因(CRVP)。 　　4．经生物信息学分析和功能筛选，初步确定平颏海蛇PLA2新基因对肿瘤细胞具有一定的毒杀作用。 　　5．建立了海蛇肽类毒素基因高效原核表达系统，成功表达和纯化了平颏海蛇PLA2和重组神经毒素。 　　6．初步建立了一个平颏海蛇毒素功能基因数据库。