[00035151]高 SOD 样活性的 SOD 模拟物

众所周知，超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内普遍存在的、唯一能清楚超氧阴离子自由基（O2.-）的金属酶。健康人的机体内 O2.-的产生与清除存在一个动态平衡，当机体发生病变或衰老时，该平衡被破坏，体内过量的 O2.-几乎可以引起所有的生物大分子降解破坏：O2.-攻击蛋白质分子使其变性，如使结缔组织中胶原蛋白失去弹性和膨胀性，皮肤出现皱纹；攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化，而生物膜是机体内极其重要的物质传递和反应的场所，它的损伤会导致水肿、溶血、器官衰竭、功能紊乱等；攻击脱氧核糖核酸，会导致基因突变，诱发肿瘤等。外源性 SOD的临床应用主要集中在抗辐射作用和治疗炎症（如肠炎、肾炎、类风湿关节炎、皮肤痒症）以及红斑狼疮等自身免疫性疾病，治疗肺气肿、心血管疾病、心肌再灌注综合症、氧中毒等，还用于预防老年性白内障、抗衰老等。 目前对于 SOD 药用酶国内外还处于研究阶段，由于天然 SOD存在口服酶解失效问题，国内外临床研究多为注射剂型。为解决口服问题，将其制成乳糖的冻干粉制剂或制成 SOD 脂质体，用可溶性高聚物如聚乙二醇（PEG）等对天然SOD进行修饰，在一定程度上提高了它的稳定性，但是成本更高。国外也有SOD 模拟物制剂的研究报道，主要是 3，5-二异丙基水杨酸铜，其具有一定的脂溶性。我组实现了 SOD的整体模拟，性能优异，在很多方面克服了天然 SOD药用酶在临床上的局限性。SOD在食品上还用作保鲜剂，在化妆品中用于抗氧化剂，在农业上还具有增强作物抗旱、抗化学药害和抗早衰的能力。 项目优势和特点： （一）天然SOD 药用酶在临床上所受到的限制 1．半衰期短，在体内停留时间通常只有 6～10分钟。 2．分子量大，一般在 32000 Da左右，外源性天然 SOD不易透过细胞膜。 3．需在低温下贮存，常温下会失去活性；不易口服，易受蛋白酶水解而失去活性。 4．外源性天然 SOD 与细胞起结合特异性低，与器官结合的特异性也较低。 5．外源性天然 SOD 主要来源于牛血、猪血等，易受污染，如疯牛病，猪瘟等。 6．外源性天然 SOD 提纯后的产品价格昂贵，远超于白金的价格，难于推广和普及。 有鉴于此，项目组从应用基础研究入手，研制突破天然 SOD 的应用限制的SOD模拟物。 （二）SOD 模拟物的独创性研制及其优异的性能 我们的科研方向独辟蹊径，仿照天然 SOD 的结构特点选择适宜的小分子作配体，与天然SOD 活性中心所具有的建树离子生成配位化合物；又对 SOD酶的疏水微环境进行了创新性的模拟；进而对模拟物分子又加以修饰，实现了对天然SOD酶的整体模拟。十年来在国家自然科学基金委员会的支持下，目前从众多研制的模拟物中已筛选出四种类型的高 SOD 样活性的SOD模拟物。 1.分子量小于1000 Da 这四种类型的模拟物在合成后经过元素分析、质谱分析，红外谱和紫外可见光谱检测、核磁共振、顺磁共振谱的测定以及四圆衍射分析，确认了他们的组成和结构，模拟物的分子量均小于 1000 Da。 2.热稳定性好 通过热分析和熔点测试，确认了所合成的 SOD模拟物固体在常温下贮存及在人体温度下其热稳定性极好，SOD样活性不受影响。例如 I型模拟物在 50℃时分解的半衰期t1/2=7.5×1033年。 3.活性高 （1）使用SOD样活性间接测定法-黄嘌呤氧化酶细胞色素C法和核黄素光还原NBT法，分别测定了四种类型SOD模拟物的IC50(抑制率为50％的模拟物的浓度)，其数值在15 ug/L～56 ug/L范围内（T＝20℃，pH7.8），小于天然 SOD 之IC50(300 ug/L)，即模拟物的 SOD活性要高于天然 SOD。 （2）使用 SOD 样活性直接测定方法-脉冲辐解法和停止流动法分别测定了四种类型的 SOD 模拟物催化 O2.-歧化反应的速率常数 k(mol-1Ls-1)。脉冲辐解法的检测单位是国家教委射线束与材料改性开放实验室，停止流动法的检测单位是北京大学生物与化学工程学院。结果如下： I型 SOD模拟物与 O2.-反应的速率常数 k值数量级为107～108。 II 型 SOD 模拟物与 O2.-反应的速率常数 k 值数量级为 108，个别的已超过9×108 mol-1Ls-1。 III 型 SOD 模拟物与 O2.-反应的速率常数 k 值数量级为 109，个别的已超过1.6×109 mol-1Ls-1，与天然SOD的k 值基本相同。（文献报道天然 SOD的k值在1.3～2.0×109mol-1Ls-1范围内）。 IV 型 SOD 模拟物与 O2.-反应的速率常数 k 值已超过 3.4×109mol-1Ls-1 (23.5℃)，同时测得天然 SOD 的 k 值为 1.85×109mol-1Ls-1.迄今未发现有如此高活性SOD模拟物的报道。 以上由检测单位用直接法测得的结果和我们用间接方法测得的结果是一致的。因为k的单位是 mol-1Ls-1，在这里天然 SOD的摩尔质量为32000 Da，而I～IV 型 SOD 模拟物的摩尔质量不超过 1000。由于在实际应用和间接方法中比较的是单位质量的活性，所以 I～IV 型 SOD 模拟物捕捉 O2.-的能力要比天然 SOD 高出数倍、数十倍！可以这样说，1克SOD模拟物的功效可能超过几克甚至几十克天然SOD的功效。 4.半衰期长 在北京大学药学院谢英博士的指导下做了I型SOD模拟物的药代动力学预试验，测定不同时兼大鼠血清中 SOD模拟物的活力（NU/ml），根据活力对时间的曲线，求得 I 型 SOD 模拟物在动物体中的半衰期为 t1/2=4.8 小时，其值比天然 SOD的体内半衰期6～10分钟要长，更适宜于在各方面的应用。 5.毒性低，安全性好 委托北京大学营养与保健食品评价中心做了 IV 型 SOD 模拟物的小鼠急性毒性试验，口服给药，雄性小鼠的半致死量 LD50=0.909 g/kg bw，雌性小鼠的半致死量 LD50=1.260 g/kg bw，IV 型 SOD 模拟物属低毒；同时做了 IV 型 SOD 模拟物口服液（浓度为0.01%）急性毒性试验，雄性和雌性小鼠的 LD50均大于 21.5 g/kg bw，口服液为无毒。在 SOD模拟物的实际应用中，其浓度约为 0.01%，因此十分安全。长期毒性以及三致试验尚待完成。 6.药效显著 诸多的研究证明，糖尿病人体内 SOD 水平明显降低，给糖尿病大鼠补充天然SOD后，能够提高机体的 SOD水平，清除过多的自由基、改善高血糖状态及纠正脂代谢紊乱。我们以糖尿病小鼠为动物模型，研究了 IV 型 SOD 模拟物灌胃给药45 天对小鼠血糖、血脂的影响以及对心脏和肾病理的改变。结果表明，对低剂量（0.002%）和高剂量（0.1%）组能改善糖尿病小鼠的血糖和血脂，对而中剂量（0.02%）组具有明显的降低血糖、调整脂代谢紊乱以及保护心，肾的作用。 试验结果证明 IV 型 SOD 模拟物可以促进机体氧自由基的清除，增强抗氧化能力，使胰岛ß细胞得到可逆性恢复，从而降低高血糖、改善血脂紊乱，保护糖尿病小鼠受损的血管，减轻血管的动脉粥样硬化，对保护大血管和微血管起到十分重要的作用，为防治糖尿病及其并发症提供了一种新的治疗手段。