[00024160]一种快速准确定位RNA分子3‘末端的方法

　　一、发明创造简介

　　核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid）主要分为3类：核糖体核糖核酸(rRNA)、信使核糖核酸mRNA)和转运核糖核酸(tRNA)，不同的鼬悄有着不同的功能。绝大多数真核生物的删盼队分子3'端具有多聚A尾(polyA)结构，一般为40-200个多聚A核苷酸。由此，可以利用删心後的这一特性设计逆转录引物，常用寡聚T核苷酸OligodT引物或是修饰的OligodT引物（在Oligo dT的5'末端增加一段核苷酸序列），通过OligodT与mRNA上的polyA相配对完成逆转录反应。经过PCR扩增、克隆后，通过序列测定可以推测出mRNA分子3'端的序列。但是其他DNA分子和少数mRNA是不具有polyA结构的，对于这些RNA序列则无法使用Oligo dT引物进行逆转录。末端转移酶（Terminal transferase, TcIT）是一种无无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。带有突出、凹陷或平骨末端的单双链姒分子均可作为TdT的底物。此外末端转移酶还有催化脱氧核苷酸结合到DNA分子3'羟基端的活性。因此本发明利用TdT的这一特性，在DNA分子3'，末端加上一连串多聚A脱氧核苷酸，将一般的砌她变成类似mRNA的DNA与DNA的杂合分子。然后每用Oligo dT或修饰的Oligo dT引物进行逆转录-PCR，就可以准确获得该RNA分子3'端的序列

　　二、创新点

　　目前利用到末端转移酶的大多试验中，均是利用其催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。本发明扩展了末端转移酶的应用范围，实现了催化脱氧核苷酸结合到RNA分子3'羟基端，从而对任意RNA分子，通过本发明可以将其改造为类似mRNA的、携带polyA尾巴的RNA分子。这样不需要使用基因特异性引物，仅通过通过的oligo dT或者修饰oligo dT引物进行逆转录-PCR，就可以准确获得该RNA分子3'端的序列。

　　三、发明的应用价值和市场前景

　　由于RNA在生物体的整个生命过程起着举足轻重的作用，因此在现代分子生物学得演技过程中，越来越多地需要测定某一RNA分子的序列。本发明没有特殊的实验试剂、实验仪器设备要求，实验方案啊也简单易行。因此具有广泛的应用领域和非常好的市场前景。