[00024147]耐热菌的QC-PCR快速定量检测方法

　　一、发明创造简介

　　中国苹果浓缩汁生产量及出口量均居世界第一，然而苹果浓缩汁中耐热菌含量常常超标，影响苹果浓缩汁质量安全，耐热菌检测是控制苹果浓缩汁质量安全的必备技术，目前通用方法是传统的细菌平皿培养记数法，检测周期长（4－5d），检测结果不能及时有效的反馈生产线以控制产品质量。本发明公开了一种QC-PCR（竞争定量PCR）快速定量检测耐热菌的方法，其技术路线是：用针筒式滤器过滤被检样品，捕集耐热菌，将滤模上捕集的耐热菌转入1.5mL的Eppendorf离心管中，采用氯化苄法提取耐热菌DNA，用本方法设计的引物1、引物2、引物3与提取的耐热菌DNA（目标模板）和特制的竞争模板进行PCR共扩增（同时设阳性和阴性对照），再经凝胶电泳检测，进行耐热菌的定量或定性判断。本发明可在10h内实现被检样品中有（≧1CFU/mL）或无（<1CFU/ mL）耐热菌的快速定性检测。也可不经预增菌环节，在4-5h内实现快速定量检测，最低检测限为5×102个目标模板/反应体系，或5×103－5×104个耐热菌/反应体系样品。此方法比传统的4-5d时间大大缩短。

　　二、创新点

　　1．成功设计了耐热菌DNA特异扩增引物和竞争模板引物。

　　2．首次建立了耐热菌的QC-PCR（竞争定量PCR）快速定量检测方法，比传统方法的检测时间大大缩短。

　　三、发明的应用价值和市场前景

　　本发明主要应用于浓缩苹果汁中耐热菌的快速检测，也适用于其他果汁或其他食品中耐热菌的快速检测。仅果汁厂，我国目前就有近100家，年生产苹果浓缩汁50多万吨，耐热菌常常超标，为果汁厂必检项目。本发明能在4-10h内实现耐热菌的快速定性及定量检测，检测结果可及时反馈生产线，以有效控制果汁质量安全，具有很高的应用价值和市场前景。