[00013426]一种4-1BBL蛋白的制备方法

　　技术描述：

　　（一）背景技术

　　4-1BB/4-1BBL是CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号分子。4-1BB（CD137）主要分布在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞等表面，其配体4-1BBL（CD137L）主要表达在专职APC细胞（如单核巨噬细胞、DC细胞、B细胞）、活化的T细胞及一些肿瘤细胞上。4-1BBL是II型跨膜糖蛋白，分子量为34KD，人和小鼠有36%的同源性。4-1BB/4-1BBL信号对增强和维持免疫应答有重要作用。与CD28/B7信号传导通路比较，4-1BB/4-1BBL主要在免疫应答的后期，为CD8+T细胞克隆扩增、存活和记忆性杀伤提供信号，具有明显刺激T细胞增殖和分泌细胞因子的作用。因此， 4-1BB/4-1BBL信号传导通路近年已成为肿瘤免疫治疗设计的一个新靶点。实验表明，4-1BB/4-1BBL信号能预防活化诱导的细胞死亡（AICD），促进荷瘤宿主中淋巴细胞的增殖，并选择性促进Ⅰ型细胞因子分泌，增强效应细胞的抗肿瘤作用。这种抗肿瘤作用对肿瘤的再次攻击有记忆性，证实有长期的抗肿瘤免疫反应存在。研究还发现，融合蛋白Ig-4-1BBL与抗-4-1BB抗体一样能有效诱导肿瘤持续的特异性CTLs，治疗小鼠肝结肠癌。

　　综上，4-1BBL重组蛋白在人类肿瘤和感染性疾病免疫治疗中有较好的应用前景。

　　（二）发明内容

　　现有技术对4-1BBL蛋白的制备方法是直接从组织细胞提取，得率低、成本高，不能大量应用于体内试验或临床。为了提高4-1BBL蛋白的得率，降低成本，为制备临床前试验用药或诊断试剂提供大量的原材料，本发明自主研发了一种4-1BBL蛋白的制备方法，所述方法是采用小鼠4-1BBL（TNFSF9，NP_033430.1）胞外段蛋白的cDNA以基因工程方法制备含206个氨基酸残基（Arg 104-Glu 309）的重组4-1BBL蛋白。采用本发明方法，可大量获得4-1BBL蛋白，大大提高了蛋白得率，获得的4-1BBL胞外段蛋白可以应用于制备对4-1BBL蛋白定量的临床前研究试剂盒或药用，应用前景广阔。

图1为重组蛋白4-1BBL促T细胞增殖实验的分析（cpm）。

图2为小鼠T细胞48h培养上清液的IL-2水平（ng/L）。

图3为小鼠T细胞48h培养上清液的IFN-γ水平（ng/L）。

　　采用本发明方法获得的4-1BBL胞外段蛋白，经刺激体外培养的小鼠T淋巴细胞，能有效增强CD3单抗活化的T淋巴细胞增殖（相对增强率为25.6％）及分泌IL-2（相对增强率为53.2％）、IFN-γ（相对增强率为65.5％）等细胞因子，显示具有显著的T细胞协同刺激作用（图1~图3）。

　　成果用途：本方法获得的4-1BBL胞外段蛋白可应用于制备对4-1BBL蛋白定量的临床前研究试剂盒或药用，应用前景广阔。

　　市场预测：可生产4-1BBL胞外段蛋白产品，用于制备对4-1BBL蛋白定量的诊断试剂盒，以及抗肿瘤、抗感染等免疫治疗临床前研究的小鼠体内实验。